هدف آزمایش :
1- آشنایی با دستگاه اسپکتروفتومتر
طیفسنجی نوری یا اسپکتروفتومتری به انگلیسی(Spectrophotometry) در شیمی، روشی است برای سنجش و مطالعه طیف الکترومغناطیسی. در این روش با استفاده از میزان اندازه جذب نور نمونهها، غلظت آنها را تعیین میکند. همچنین از آن میتوان برای تجزیه و تحلیل نمونههای دیانای و آرانای استفاده نمود.
این شیوه در دستگاه طیفسنج نوری با نام اسپکتروفوتومتر مورد استفاده قرار میگیرد.
روشهای طیف سنجی براساس بر هم کنش تابش الکترومغناطیسی با ماده بنیان گذاری شده است و چون امواج الکترومغناطیس، حاصل کاهش سرعت ذرات با بار الکتریکی است بنابراین توسط ماده جذب شده و سبب افزایش سرعت ذرات می گردد. علاوه بر این انرژی نورانی در بر هم کنش با ماده و جذب آن توسط ماده، باعث برانگیختن ماده به ترازهای انرژی بالاتر می گردد. بنابراین بسته به شدت و قدرت انرژی وارده به ذره با ماده بر هم کنش کرده و پدیده خاصی را سبب می گردد که اساس اندازه گیریهایی نظیر اسپکتروفتومتری را تشکیل می دهد.و می تواند شامل کلیه نواحی طیف الکترومغناطیس از اشعه گاما و ناحیه مریی تا امواج رادیویی باشد. در این رابطه، روشهای جذب، نشر، شکست، پراش (Diffraction) و پلاریزه شدن نور را می توان مورد توجه قرار داد که مهمترین آنها روشهای اسپکتروفتومتری جذبی و نشری و فلورسانس است.
طول موج نور مریی بیشتر و در نتیجه انرژی آن کمتر از UV است. در اثر تابش نور به ماده در آن نقل و انتقالات الکترونی صورت می گیرد، e ها تحریک شده و به سطوح انرژی بالاتر می روند. بسته به ساختمان شیمیایی جسم، نقل و انتقالات الکترونی مختلفی می تواند صورت گیرد، و محل جذب بستگی به ساختمان شیمیایی ماده دارد. بنابراین از gmax برای شناسایی مواد استفاده می شود که طول موجی است که در آن حداکثر جذب صورت می گیرد و برای تعیین غلظت جسم مجهول gmax را به نمونه می تابانیم. مقدار جذب از قوانین جذب Bear & Lambert پیروی می کند و از رابطه A=e lc محاسبه می شود.
معمولا در محدوده ای که جذب با غلظت رابطه خطی دارد ،تعیین مقدار انجام می شود.اگر غلظت نمونه و استاندارد به هم نزدیک باشد و غلظتها هم در محدوده خطی باشند، می توان با استفاده از تناسب محاسبات را انجام داد.
اجزاء و قسمته:
اسپکتروفتومتر از دو بخش اسپکترومتر و فتومتر تشکیل شده است. اسپکترومتر بخشی است که نور منوکروم را ایجاد کرده و دارای منبع نور، عدسی، شکافها، منوکروماتور (صافی، منشور یا ((Grating system) می باشد. بخش فتومتر دارای اسباب سنجش نور می باشد.
1- منبع نورانی:منبع نور مورد استفاده در اسپکتروفتومتر بسته به ناحیه مورد استفاده، متفاوت می باشد. برای نورهای مرئی از لامپ تنگستن استفاده می شود که نورهایی با طول موج بین 350 تا 800 نانومتر ایجاد می کند. و برای نورهای ماوراء بنفش (UV) از لامپ جیوه، هیدروژن استفاده می شود. این لامپها در ناحیه بین 200 تا 600 نانومتر بکار می روند. در دستگاههای پیشرفته تر هر دو نوع لامپ وجود دارد.
2- عدسی ها: (آینه ها): برای کنترل کردن مسیر نور، وجود عدسی لازم است. به جای عدسی ها از آینه هایی که به شکل نیمدایره یا محدب ساخته شده اند می توان استفاده نمود.
3- شکافها (slits): در هر اسپکتروفتومتری دو شکاف وجود دارد: یکی را شکاف ورودی و دیگری را خروجی می گویند. شکافها رل مهمی در جداکردن نور دلخواه با طول موج مشخص دارند. به همین جهت اندازه این شکافها بسیار مهم هستند. بیشتر دستگاهها پیچی دارند که اندازه این شکافها را می توان برحسب احتیاج تغییر داد. هر چه طول این شکافها بیشتر باشد پهنای نور عبوری (band-pass) بیشتر بوده و دامنه طول موج آن نیز زیاد می باشد و به عبارت دیگر نورهای دیگری که مورد نیاز نیستند عبور می کنند. این نور اضافی را Stray light می نامند
4- منوکروماتور(monochromators): اشعه نورانی پس از عبور از عدسی ها و شکاف مقدار و مسیر آنها کنترل شده سپس به دستگاهی که می تواند نور پلی کروم را به منوکروم تبدیل کند وارد می شود. پس نوری با طول موج مشخص و انتخابی به وجود می آورند. دو نوع منوکروماتور وجود دارد منشور و Grating.
5- محل نمونه:ظرف محتوی نمونه را سل یا کووت (cuvett) می نامند که از جنس شیشه، کوارتز یا پلاستیک است. برای اندازه گیری شدت رنگ محلولها و بلانک بکار می رود. سلهای شیشه ای و پلاستیکی برای ناحیه مرئی به کار می رود و در ناحیه ماوراء بنفش از سل کوارتز استفاده می شود. طول سلها معمولا 1 سانتی متر است و سلهایی با طول cm 1/0 تا cm 10 نیز موجود می باشد. محل قرار گرفتن نمونه بسته به اینکه دستگاه جایگاه جدا برای رفرنس (بلانک) دارد یا نه، Single beam و Double beam نام دارد. و کووت ها برحسب نوع شیشه و شکل چند نوع می باشند.
1- کووتهای مکعبی: سطح مقطع این کووت ها مربع بوده و از جنس شیشه خالص (برای نورهای مرئی) و کوارتز( برای نور ماوراء بنفش) می باشند. شیشه نور مرئی را از خود عبور می دهد ولی نور ماوراء بنفش را به مقدار زیادی جذب می کند. کووتهای مکعب، گران و کارکردن و تمیز نگهداشتن آنها دقت بسیار لازم دارد.
2- کووتهای گرد: سطح مقطع این دسته از کووتها گرد بوده و برای کارهای روزمره آزمایشگاهی بکار می روند. با همه دقتی که در ساختن کووتها می شود ،مکرر دیده می شود که آیا A دو کووت مشابه، یکسان نیست. برای جلوگیری از استفاده کووتهای ناجور باید آنها را کالیبره نمود.
برای کالیبره کردن کووتها محلولی را که نسبتا پایدار است مثل هموگلوبین با غلظت 50 میلی گرم درصد میلی لیتر تهیه می نمایند. باید T این محلول در طول موج nm 540 برابر 3/0 ± 50% باشد. راه دیگراینست که به جای کالیبره کردن کووتها از یک کووت برای شاهد و استانداردو نمونه استفاده کنند.
6- دتکتور (نور سنج): نور پس از عبور از عدسیها و شکافها و منوکروماتور به محلول لوله آزمایش رسیده و از آنجا به نورسنج می رود. اسباب منوکروماتور، نور دلخواه و با طول موج مشخص را به لوله آزمایش می تاباند. رنگ این نور مکمل رنگ محلول است. اگر رنگ محلول سبز- آبی (مثل تعیین مقدار گلوکز بوسیله ارتو تولوییدین) به طول موج nm 495-475 باشد رنگ فیلتر- منشور یا گریتینگ باید نارنجی یا نزدیک آن با طول موج بین nm 620-600 باشد. چون رنگهای نارنجی مکملش سبز-آبی است. بنابراین وقتی منوکروماتور رنگ مکمل رنگ محلول را به لوله آزمایش می تاباند مقداری از آن به وسیله محلولی که در لوله وجود داشته و بستگی به غلظت مواد مورد آزمایش دارد ،جذب شده و بقیه آن به نورسنج می رسد. نورسنج با تبدیل انرژی نورانی به انرژی الکتریکی قادر است که مقدار جذب این نور را به وسیله محلول و یا درصد ترانس – میتانس آن اندازه گیری نماید. دتکتورها شامل انواع فتوشیمیائی، فتوالکتریکی و حرارتی می باشد که در ناحیه مرئی و ماوراء بنفش از دتکتورهای فتوالکتریکی مانند فتوولتتیک و فتوتیوب و فتومولتی پلایر تیوب استفاده می شود.
7- رکوردر (الکتریک سنج)در اسپکتروفتومتر احتیاج به دستگاهی است که جریان الکتریکی دتکتور را اندازه بگیرد. دو سیستم گالوانومتر و نول پوینت وجود دارد که در اسپکتروفتومترهایی که دارای نواحی مرئی باشند معمولا از یک گالوانومتر یا صفحه دیجیتالی استفاده می شود.
روش انجام آزمایش:
|
Α
|
λ
|
|
051/0
|
400
|
|
021/0
|
450
|
|
140/0
|
500
|
|
324/0
|
530
|
|
614/0
|
560
|
|
142/1
|
590
|
|
218/0
|
620
|
|
009/0
|
650
|
دستگاه اسپکتروفتومتررا با آب مقطر صفر کردیم. وبعد از ارلن مقداری را داخل سل ریختیم و بعد از اینکه دستگاه را صفر کردیم سل را داخل دستگاه گذاشتیم و دستگاه را روی طول موج 400 تنظیم کردیم و همین کار را ادامه دادیم به این صورت که تا 500پنجاه تا پنجاه تا طول موج را تنظیم میکردیم و از 500 تا 650 سی تا سی تا و بعد از این طول موج پیش رفتیم وλ های بدست آمده را یادداشت کردیم.